抗體和其它分子的共價(jià)標(biāo)記

     以共價(jià)鍵結(jié)合的熒光染料FITC既能標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)總蛋白、又能更廣泛地標(biāo)記各種特異性配體。這些配體是能與不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)很強(qiáng)很特異地結(jié)合的各種大分子和小分子，如蛋白、多聚核苷酸、脂類以及其他生物分子、被標(biāo)記的特異性配體能夠探測(cè)很多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的參量。例如：被標(biāo)記的外源凝集素可檢測(cè)細(xì)胞表面糖；被標(biāo)記的抗體可檢測(cè)表面抗原；被標(biāo)記的多聚陽離子可檢測(cè)表面電荷，被標(biāo)記的激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和病毒等可以檢測(cè)細(xì)胞受體；被標(biāo)記的大分子、微生物或者塑料微球可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)吞性；被標(biāo)記的BrdU單克隆抗體可檢測(cè)細(xì)胞的DNA合成；用熒光素標(biāo)記的親和素以及用帶有dUTP的生物素衍生物的DNA探針與靶DNA雜交能夠檢測(cè)原位的特殊基因。用這種技術(shù)，能夠追蹤感染的原因、致癌基因、基因缺陷，有助于發(fā)展原位雜交的程序和進(jìn)行染色體分析?？傊?，利用熒光探針標(biāo)記各種配體的方法是研究活細(xì)胞、死細(xì)胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的有力手段。

    對(duì)于抗體和其它配體分子共價(jià)標(biāo)記的熒光探針除FITC外，近年來又發(fā)展了很多新的熒光探針，他們的一些理化特性和結(jié)構(gòu)式，分別介紹它們的特性。

    FITC是zui常用的熒光共價(jià)標(biāo)記物，它的一些特性已經(jīng)在總蛋白含量一節(jié)中述及。此外，它易溶于水，很容易共價(jià)聯(lián)結(jié)在抗體、外源凝集素、抗生物素蛋白、激素、脂類、蛋白類似物以及其他生物分子上，每個(gè)被標(biāo)記分子可標(biāo)記2—8個(gè)熒光素分子。FITC有較高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)額（在蛋白中為0.5），適用于氬離子激光器的488nm譜線激發(fā)。其缺點(diǎn)是所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與pH有關(guān)，當(dāng)pH低于8時(shí)，熒光顯著下降。另一個(gè)問題是FITC的激發(fā)波長(zhǎng)處于產(chǎn)生自發(fā)熒光的光譜區(qū)，所以FITC熒光受到自發(fā)熒光的干擾。自發(fā)熒光是當(dāng)受光激發(fā)時(shí)，末染色的細(xì)胞本身組分所發(fā)的熒光。FITC熒光主要受細(xì)胞內(nèi)核黃素自發(fā)熒光的影響，測(cè)量時(shí)必須排除。

    另一種常用的共價(jià)標(biāo)記探針是若丹明。若丹明比FITC光穩(wěn)定性好，在生理?xiàng)l件不對(duì)pH變化不敏感，其熒光受細(xì)胞的自發(fā)熒光干擾較小。問題是不易溶于水，使其偶聯(lián)配體后熒光的量子產(chǎn)額較FITC低。TRLTC（Teteamethylrho damine isothioc yanate，四甲基異硫氰基若丹明）、XRITC（Rhodamine X isothiocyanate，異硫氰基若丹明 X）和Texas Red（德州紅）都是若丹明的衍生物，是常用的共價(jià)標(biāo)記探針。FITC和TRITC是zui早使用的一組雙標(biāo)記配體的熒光探針，前者發(fā)綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。但是由于FITC和TRITC的量子產(chǎn)額不匹配，（FITC遠(yuǎn)大于TRITC），以及它們之間光譜范圍有較多交叉，容易產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，因此以后又發(fā)展了XRITC和Texas Red。當(dāng)用FITC和XRITC或者FITC和Texas Red作雙標(biāo)記工作時(shí)，選用合適的兩組激光光源和濾片系統(tǒng)，可使兩種信號(hào)之間沒有多少光譜交叉。但也存在一些問題，例如由于XRITC的疏水特性，使與其偶聯(lián)的蛋白不易溶解，并且未與蛋白結(jié)合的染料也不易被洗掉。Texas Red有鈍化抗體的傾向，造成熒光信號(hào)較弱，現(xiàn)在多采用Texas Red標(biāo)記抗生物素蛋白，這種標(biāo)記物與生物素偶聯(lián)的抗體有*的親和力。

     藻膽蛋白是近年來用于免疫熒光分析和標(biāo)記各類配體的一類新熒光探針。藻膽蛋白（Phycobiliprotein）是在光合藍(lán)藻（氰菌）和紅藻中發(fā)現(xiàn)的天然熒光色素家族。藻膽蛋白的色素基是后膽色素（Bilins），每個(gè)藻膽蛋白分子含有很多后膽色素。利用藻膽蛋白標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是：對(duì)不同類型的藻膽蛋白可用不同波長(zhǎng)范圍的光激發(fā)，但發(fā)射波長(zhǎng)變化不大。由于藻膽蛋白分子具有許多發(fā)色團(tuán)，它的消光系數(shù)和量子產(chǎn)額都很高。由于斯托克斯位移大，激發(fā)光和發(fā)射熒光容易被分開。藻膽蛋白易溶于水，熒光不易猝滅，對(duì)pH變化不敏感。此外，用雙功能交聯(lián)劑與抗體偶聯(lián)，不影響抗體的活性。但是藻膽蛋白的使用也存在些問題，例如由于藻膽蛋白的分子量很大，難于標(biāo)記小分子以及細(xì)胞內(nèi)的抗原或受體。

在各類藻膽蛋白中，PE（Phycoerythrin，藻紅蛋白）的分子量為240K，激發(fā)峰為490—560nm，發(fā)射峰為575nm；PC（Phycocyanin，藻青蛋白）分子量224K，激發(fā)范圍為580—620nm，發(fā)射峰為640nm；APC（Allophycocyanin，別藻青蛋白），分子量為110K，激發(fā)范圍為600—650nm，發(fā)射峰為680nm,用氬離子激光器的488nm激發(fā)藻紅蛋白，可得到較強(qiáng)的橙色熒光，所以可用PE和FITC對(duì)各種抗體或配體進(jìn)行雙標(biāo)記。

根據(jù)不同的來源，藻紅蛋白分為R-PE，S-PE和B-PE；藻青蛋白分為R-PC和C-PC等幾種類型。在同樣的條件下，若以488nm激發(fā)，S-PE溶液是FITC溶液熒光強(qiáng)度的19倍，是R-PE溶液熒光強(qiáng)度的2倍。來源于紅藻的藻紅蛋白（R-PE）強(qiáng)2倍。同樣，來源于某些紅藻的藻青蛋白（R-PC）比來源于其他紅藻或細(xì)菌的藻青蛋白（C-PC）對(duì)550nm的光激發(fā)效率高。

上述介紹的各種共價(jià)標(biāo)記的熒光探針，根據(jù)它們光譜特性的區(qū)別，選擇性地使用激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參量分析。氬離子激光器的488nm線和汞燈的485nm線用于激發(fā)熒光素、藻紅蛋白和碘化丙啶。氪離子激光器的568nm用于激發(fā)德州紅、染料激光器的600nm用于激發(fā)德州紅和別藻青蛋白。