精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光檢測(cè)試劑是一種旨在使用透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來(lái)定量檢測(cè)精子細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于動(dòng)物和人體精子細(xì)胞的活性氧族的檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。其中精子細(xì)胞（spermatozoa）對(duì)于活性氧較為敏感：低濃度活性氧可以調(diào)節(jié)正常精子功能、精子獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合等；高濃度活性氧則影響精子細(xì)胞的質(zhì)量和功能，因?yàn)榫蛹?xì)胞質(zhì)膜含有大量不飽和脂肪酸，胞漿含有少量的祛除活性氧的相關(guān)酶蛋白，由此活性氧容易造成精子質(zhì)膜的流動(dòng)性和DNA完整性受到損害，精子運(yùn)動(dòng)能力降低，不能參與授精活動(dòng)，zui終導(dǎo)致特發(fā)性不育癥（idiopathic infertility）。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydro fluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)產(chǎn)品，一種*自由通過(guò)細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過(guò)氧化氫、過(guò)氧化基、過(guò)氧亞硝基陰離子等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定精子細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   毫升

染色液（Reagent B）   微升

稀釋液（Reagent C）   毫升

保存液（Reagent D）        毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于樣品孵育

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：用于精子細(xì)胞計(jì)數(shù)

（共聚焦）熒光顯微鏡或：用于觀察熒光精子細(xì)胞

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于精子細(xì)胞熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 移取2毫升新鮮收集（1小時(shí)內(nèi)）的精液到2毫升離心管
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻精子細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入適量的清理液（Reagent A）
• 充分混勻后，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 調(diào)整精子細(xì)胞數(shù)為1 X 107/毫升
• （選擇步驟）放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時(shí)內(nèi)）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，輕柔混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育40分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx微升保存液（Reagent D），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述精子細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取400微升上述精子細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入xx微升保存液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)須戴手套
• 建議無(wú)菌操作，尤其不可污染母液
• 樣品檢測(cè)前，建議在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 精子細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)乘上稀釋倍數(shù)104。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Hemocytometer）的計(jì)算方法是：

1毫米方塊的細(xì)胞計(jì)數(shù)X 104（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)胞數(shù)/毫升

• 染色完成后，即刻進(jìn)行檢測(cè)分析，否則影響檢測(cè)
• 本產(chǎn)品也可用于凍存精子細(xì)胞的檢測(cè)分析
• 如果背景過(guò)深，調(diào)整染色工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過(guò)度染色
• 本公司提供陽(yáng)性對(duì)照甲萘醌溶液（12041），觀察細(xì)胞熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
• 正常精子細(xì)胞活性氧陽(yáng)性率較低，通常為小于4%
• 如果需要使用流式細(xì)胞儀分析，建議使用精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）細(xì)胞流式儀檢測(cè)試劑盒—14033
• 本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

使用承諾

秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書(shū)所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書(shū)面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

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14036.1 精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧高質(zhì)熒光檢測(cè)試劑盒 20次

14036.1A 清理液（Reagent A） 毫升

14036.1B 染色液（Reagent B） 微升

14036.1C 稀釋液（Reagent C） 毫升

14036.1D 保存液（Reagent D） 毫升

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