HPLC的分類

HPLC可以分為很多類別，按分離機(jī)制可分五種主要類型

1. 液固吸附色譜

以吸附劑為固定相，以不同極性的溶劑為流動(dòng)相，根據(jù)試樣中各組分吸附能力的不同而進(jìn)行分離的方法，稱液相吸附色譜。在HPLC中常用全多空型硅膠微粒為吸附劑，直徑5-10um，由于顆粒小且多空，故柱效很高。

1. 液-液分配色譜

流動(dòng)相與固定相均為液體的色譜法，稱液-液分配色譜法或簡(jiǎn)稱液-液色譜法，按照固定相和流動(dòng)相極性的差別，可分為正相和反相色譜法兩類。

1. 正相液液色譜法 流動(dòng)相極性小于固定相的液-液色譜法稱正相液-液色譜法。洗脫時(shí)，極性小的組分先流出色譜柱，極性打的組分在固定相中溶解度大，后流出色譜柱。

原始的正相色譜以含水硅膠為固定相，以乙烷經(jīng)等為流動(dòng)相，由于固定液易流失，已被化學(xué)鍵合色譜法取代，化學(xué)鍵合相是將固定液化學(xué)鍵鍵合在載體表面形成的固定相。正相色譜常用的氰基鍵合相，性質(zhì)與硅膠的性質(zhì)差異較大，常用語(yǔ)糖類的分析。

正相色譜以郵寄溶劑為流動(dòng)相，使用成本較高。

1. 反相液-液色譜法 流動(dòng)相極性大于固定相的液-液色譜法稱反相液-液色譜法，洗脫時(shí)樣品中急性大的組分縣流出色譜柱。為了防止固定液的流失，反相色譜法均使用化學(xué)鍵合相，典型的反相化學(xué)鍵合相，用多孔載體上化學(xué)鍵合的十八烷基為固定相，流動(dòng)相常用甲醇-水和乙腈-水。非典型反相色譜系統(tǒng)，由弱極性或中等極性的鍵合相和極性大于固定相的流動(dòng)相構(gòu)成。

反相鍵合色譜法固定相不流失，流動(dòng)相以水為主，用甲醇或乙腈調(diào)節(jié)極性，應(yīng)用范圍很寬，且使用成本低，用HPLC中應(yīng)用zui廣。

一般的反相色譜法，主要用于分離分析非極性和中等極性的化合物，但用兩種改進(jìn)的方法，亦可分離離子化合物。其一為離子對(duì)色譜法，在流動(dòng)相中加入樣品離子的反粒子，使其與樣品離子構(gòu)成不荷電的中性離子對(duì)，增加其在非極性固定相中的溶解度，使分配系數(shù)增加，改善分離效果。分析堿類時(shí)可在流動(dòng)相中加入烷基磺酸鹽(PIC），分析酸類則加入四丁基胺磷酸鹽(TBA)等。這種方法可以使C18柱子一柱多用，用其取代離子交換法，可避免離子交換法流動(dòng)相對(duì)泵和流路的腐蝕，缺點(diǎn)是PIC試劑較貴，其二為離子抑制色譜法，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH，抑制樣品則分的解離，增加其在固定相中的溶解度。在流動(dòng)相中加入醋酸等弱酸，氨水等弱堿，磷酸鹽及醋酸鹽等緩沖鹽調(diào)節(jié)ph即可用于分離有機(jī)酸和有機(jī)堿。這種方法比離子對(duì)法成本低，但重復(fù)性差，且要注意，流動(dòng)相PH應(yīng)在2-8之間，超出此范圍可能使鍵合基團(tuán)脫落、試驗(yàn)后要及時(shí)用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗，以防腐蝕儀器流路系統(tǒng)。

1. 離子交換色譜

由于聚苯乙烯樹脂類具膨脹性，不耐壓，HPLC的離子交換劑多用薄殼形或多孔微粒硅膠為載體，表面化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，常用的為強(qiáng)酸性磺酸基和強(qiáng)堿型季銨鹽。一種全多空硅膠為基體的離子交換劑柱效高，載樣量大，有較好的耐壓性和理化穩(wěn)定性，但在PH＞9的流動(dòng)相中硅膠易溶解，未鍵合的殘留硅純基易生成硅酸鹽，故只能在PH0-8使用，層析過(guò)程中要控制流動(dòng)相的PH的離子強(qiáng)度

1. 空間排斥（凝膠）色譜

葡聚糖等軟質(zhì)凝膠在壓強(qiáng)0.1Mpa左右即被壓壞，不宜在HPLC使用。由苯乙烯和二乙烯交聯(lián)而成的半硬質(zhì)凝膠注銷較高，常用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，缺點(diǎn)是具膨脹性，流動(dòng)相流經(jīng)時(shí)柱的填充狀態(tài)會(huì)發(fā)生變化。以多空硅膠及多孔玻璃珠等無(wú)機(jī)材料制成的硬質(zhì)凝膠，在溶劑中不變形，但裝柱時(shí)易碎，柱效較差，吸附性較強(qiáng)，有時(shí)易拖尾、

5親和色譜

常用的基質(zhì)有高度交聯(lián)的Sephadex和Bio-geldeng 瓊脂糖凝膠，大孔徑聚丙烯酰胺凝膠和多孔硅膠，配基選擇及交換劑合成的原理類似經(jīng)典親和層析，目前已有許多商品化的親合色譜固定相和色譜柱可供選擇。

此外，還有手性固定相HPLC，在生物化學(xué)中使用不多，故不再介紹。