硝基四氮唑藍(lán)染色法、結(jié)晶紫染色法、固紫染色法、及Ziehl-Nidlsen染色法

硝基四氮唑藍(lán)染色法：

感染引起細(xì)胞內(nèi)還原性輔酶I的活力增強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用部位，導(dǎo)致無色的四氮唑藍(lán)（nitroblue tetrazoliun test,NBT)被還原為不溶于水的藍(lán)色沉淀物。這種大塊狀藍(lán)色沉淀物僅見于成熟和幼稚的嗜中性粒細(xì)胞胞漿中。文獻(xiàn)報(bào)道在細(xì)菌和真菌感染時(shí)，嗜中性粒細(xì)胞百分率升高（＞12%），康復(fù)期恢復(fù)正常。而病毒和結(jié)合感染時(shí)大多陰性。NBT測定還可以作為疾病病程和抗生素療效指標(biāo)。

1、操作步驟如下

①將腦脊液與NBT工作液各0.5ml混合后，置于腦脊液細(xì)胞玻片離心沉淀器中。

②37℃水浴箱中孵育15min；

③取出腦脊液細(xì)胞沉淀器，離心后取下玻片，空氣干燥；

④MGG染色

2、主要試劑的制備

①磷酸緩沖液（0.15mol/L);Na2HPO41.52g， KH2PO4 0.496g，加入9g/L NaCl中之100ml，溶解后校正PH為7.2.

②NBT染液：臨用時(shí)將2g/L NBT生理鹽水溶液與上液等量混合即成。

結(jié)晶紫染色法：

結(jié)晶紫染色法操作簡單，主染核，變性細(xì)胞染色較淡。其原理是結(jié)晶紫染色可通過細(xì)胞的特定攝生法而選擇性地被細(xì)胞核吸收，死亡的細(xì)胞幾乎不吸收結(jié)晶紫燃料。

具體操作步驟：

①甲醇固定1min

②0.1%結(jié)晶紫水溶液3-5min

③96%乙醇分化2-3

固紫染色法：

固紫染色即（Gram染色。固紫陽性菌（鏈球菌等）染成深藍(lán)色，而奈瑟菌屬如腦膜炎雙球菌，假單胞菌如綠膿桿菌、腸道桿菌等則成陰性。

操作步驟

①干片于火焰上稍稍固定

②浸入結(jié)晶紫溶液中0.5-1min

③流水沖洗；

④浸入Luqol濃碘溶液中1min

⑤96%乙醇溶液中脫色

⑥流水沖洗

⑦浸入品紅溶液中1min

⑧流水沖洗待干。

溶液的制備

①Hucker結(jié)晶紫溶液。結(jié)晶紫200mg溶于蒸餾水*90ml內(nèi)，再加0.1mol硼酸及硼酸鹽緩沖液10ml（PH9.0）。此液需新鮮配置，不得過頁。

②Luqol濃碘溶液。碘化鉀2g溶于蒸餾水10ml內(nèi)，加碘1g，蒸餾水加至300ml。

③品紅溶液。蒸餾水100ml中韓品紅200mg。

Ziehl-Nielsen染色法：

抗酸染色（acid-fast stain）1982年由Ziehl-Nielsen*，因此又稱為萋-納氏（Ziehl-Nielsen）染色，主要針對抗酸桿菌。抗酸桿菌屬分枝桿菌，由于菌體壁上含有大量的脂類，一般染色不易著色，但能與堿性品紅染液結(jié)合成復(fù)合物，可抵抗算脫色作用，成紅色，背景藍(lán)色，對比清晰。

步驟如下：

①圖片干燥后，火焰或乙醇乙mi固定：

②滴加石碳酸付紅液于玻片上，火焰上徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，切不可沸騰，5min；

③崎嶇石碳酸液，流水沖洗；

④浸入3%的鹽酸酒精中搖蕩至無紅色脫落為止；

⑤流水沖洗；

⑥堿性美藍(lán)溶液負(fù)染30s

⑦流水沖洗，干后鏡檢。

溶液的制備：

①石碳酸品紅溶液：堿性品紅0.5g、無水乙醇10ml、石碳酸5g、蒸餾水90ml（堿性品紅乙醇飽和溶液10ml，5%石碳酸溶液90ml）

②鹽酸究竟：濃鹽酸3ml，95%乙醇97ml

③美蘭液；95%乙醇飽和美蘭液30ml加入10%氫氧化鉀0.1ml，蒸餾水100ml。

注意事項(xiàng)：

①抗酸染色用于細(xì)胞學(xué)圖片上時(shí)，可以適當(dāng)增加標(biāo)本的厚度以提高檢出率。

②細(xì)胞學(xué)圖片以火焰固定為好。

③品紅加熱不宜過猛過長。因?yàn)槟X脊液中的結(jié)核桿菌比較赤裸，不像痰中結(jié)核桿菌包埋在粘液中，溫度過高可使細(xì)菌炸裂和難于辨認(rèn)。

在做北京染色時(shí)（即蘇木精染色）盡量淺染，以免掩蓋紅色桿菌色調(diào)，影響檢出效果。

⑤該法常用石碳酸付紅染液覆蓋標(biāo)本后加溫，冒蒸汽開始計(jì)時(shí)，隨時(shí)添加染液，保持濕潤，防止干燥，知道5min位置。染液用量多，操作復(fù)雜，并容易流到玻片外，沾污水或試驗(yàn)臺(tái)。針對傳統(tǒng)的抗酸染色發(fā)的不足，許多學(xué)者對染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，改良法將石碳酸付紅染色液先在沸水浴中加溫10min，在進(jìn)行染色，結(jié)果尚可，可避免以上不足。