熒光免疫分析淺談

     1950年coons合成異硫氰酸鹽（熒光染料），用作標記抗體做小鼠組織切片染色，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique)，又稱為熒光抗體技術(shù)（Fluorescent antibody technique).由于漿抗原,抗體的反應(yīng)特異性與熒光的敏感性結(jié)合起來，因此，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué),生物學(xué),分子生物學(xué),生物化學(xué),免疫學(xué)等領(lǐng)域，它分為創(chuàng)痛的免疫熒光技術(shù)和現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)。

傳統(tǒng)的免疫熒光技術(shù)用異硫氰酸熒光黃（FITC),羅丹明標記特異抗體，對組織切片,細胞細菌,病毒和液體物質(zhì)作固相熒光染色，熒光顯微鏡下分析熒光狀態(tài),分布。該技術(shù)及流式細胞儀和熒光偏振分析從至今仍廣泛用于臨床診斷和基礎(chǔ)研究。

現(xiàn)代熒光技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展十分廣泛，如蛋白質(zhì),DNA，細胞膜受體，細胞內(nèi)物質(zhì)，復(fù)合抗體，亞細胞分子的標記等。儀器*。如熒光激活細胞分類儀(FACS)，單克隆熒光技術(shù)電子計算機圖像顯示儀，熒光自動化分析測試儀?，F(xiàn)代熒光免疫技術(shù)在標記與探測上，稀土元素Eu配合物抗體標記Eu（TIFA)的靈敏度。此外，還有競爭性可磁性固相熒光，雙位點免疫熒光等。20世紀80年代在普通熒光標記基礎(chǔ)上發(fā)展的新技術(shù)—時間分辨熒光技術(shù)（TRFIA)是以稀土離子標記抗原或抗體，建立的細胞，核酸探針新技術(shù)。

將熒光法引入免疫分析主要是因為它與分光光度法相比具有高的靈敏度，其靈敏度是分光光度法10—1000倍。人們尋找單分子檢測的工作幾乎都圍繞著熒光化合物，這本身就反映了熒光法在提高分析靈敏度方面的潛力。另外，熒光測定可以把熒光激發(fā)波長，熒光發(fā)射波長，熒光壽命，偏振等參數(shù)同時結(jié)合起來，形成特異而花樣繁多的分析系統(tǒng)。

熒光免疫分析的原理：

免疫熒光技術(shù)是以熒光素標記抗體（或抗原),利用被檢物質(zhì)在反應(yīng)體系中特異結(jié)合位點熒光的強弱，有熒光顯微鏡,流式細胞分析儀和自動化電子成像計算機進行定性,定量分析的技術(shù)。通常用熒光素表及抗體,稱為熒光抗體技術(shù):其次是熒光素標記抗原，稱為熒光抗原技術(shù)。熒光素是具有共軛雙鍵體系結(jié)構(gòu)的化合物，當接受紫外光等照射時，由低能量級的基態(tài)向高能級躍遷，形成電子能量較高的激發(fā)態(tài)。當墊子從激發(fā)態(tài)恢復(fù)支基態(tài)時，發(fā)出熒光

熒光標記抗體

一 FITC標記法（透析袋內(nèi)滲透標記）

1將FITC溶于0.5mol/L，PH=9.2的碳酸鹽緩沖液中，使用FITC的zui終濃度為8-10mg/ml、2 將帶標記的抗體裝入透析袋內(nèi)，4度條件下用0.15mol/L，氯化鈉溶液透析2D，期間換液3次。然后改用0.05mol/L，PH=8.5的碳酸鹽緩沖生理鹽水繼續(xù)透析4-5Hzui后，自用0.05mol/K.PH=9.2的碳酸鹽緩沖生理鹽水透析2h

3將該透析袋置于上述FITC溶液中透析，使用熒光素與抗體IgG結(jié)合。FITC的zui終濃度是0.1mg/ml。體積是透析袋IgG溶液體積的10倍。在4度條件下，透析14-16H

標記抗體的純化

   純化的母的在于消除未結(jié)合的游離熒光素和結(jié)合熒光素過多的抗體。

將熒光素標記的抗體裝入透析袋中，先用流水透析10秒。然后用0.01mol/LPH=7.1的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水透析一周時間期間每天換液3次，直到外透析液在紫光燈下發(fā)射硬廣為止。