主要用途

D細(xì)菌甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)底物甲羥戊酸受到甲羥戊酸激酶磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以分析樣品中甲羥戊酸激酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌樣品的甲羥戊酸激酶活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

比色皿或96孔板：用于光譜分析操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升D裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8． 加入xx微升D活性液（Reagent B）

9． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

10． 置于冰槽里15分鐘，期間每隔5分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

11． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用D BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30031.1）

14． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)菌裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零

3． D緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升D緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升D酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升D反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升D底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入xx微升D陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升D緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升D酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升D反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升D底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)菌裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升D緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升D酶促液（Reagent D）

4． 分別加入x微升D反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升D底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入xx微升D陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)菌裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和10分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定

7． 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘

8． 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗充分

9． 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于10分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供 D BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30031.1）

11． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 甲羥戊酸激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

13． 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品