主要用途

動物組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過自由基探針魯米諾和強(qiáng)化劑的參與下，組織樣品中的活性氧族使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光儀（Luminometer）的幫助下定量檢測樣品中活性氧族的生成和數(shù)量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動物和人體組織的活性氧族的檢測。可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。魯米諾（luminol），又稱氨基鄰苯二甲酰肼（luminol； 3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一種脂溶性的發(fā)光劑，氧化后生成魯米諾自由基而化學(xué)發(fā)光，具有460nm左右峰值的帶狀光譜，肉眼可觀察到鮮明的紫藍(lán)色。魯米諾以單價(jià)氧化形式與超氧自由基陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生不穩(wěn)定性內(nèi)過氧化物或二氧環(huán)丁烷（Dioxetane），由此分解成電激發(fā)狀態(tài)，通過釋放光子，回復(fù)到基態(tài)。魯米諾作為探針，可以檢測組織細(xì)胞中超氧自由基陰離子和羥自由基，其發(fā)光強(qiáng)度與水平成正相關(guān)。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）            毫升

強(qiáng)化液（Reagent B）            毫升

發(fā)光液（Reagent C）            毫升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存強(qiáng)化液（Reagent B）和發(fā)光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機(jī)：用于去除樣品雜質(zhì)

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品

超聲儀：用于裂解組織樣品

測試管或黑色96孔板：用于發(fā)光檢測用的容器

化學(xué)發(fā)光儀：用于檢測化學(xué)發(fā)光

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品預(yù)處理

1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量 

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管（200毫克組織）

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）

4． （選擇步驟）小心抽去清理液（Reagent A）

5． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

6． 加入置于冰槽里的xx毫升清理液（Reagent A） 

7． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

8． 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）

9． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩5秒，充分混勻

11． （選擇步驟）在冰槽里，置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊5秒

12． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． （選擇步驟）移取5微升進(jìn)行蛋白定量測定，并調(diào)整蛋白濃度為20毫克/毫升（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（1小時(shí)內(nèi)）

二、 測讀

測讀開始前，打開化學(xué)發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測讀1秒；然后關(guān)掉實(shí)驗(yàn)室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴(yán)格置于暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備好測試管，做好標(biāo)記：陰性對照、樣品本底和樣品活性

2． 移取xx微升清理液（Reagent A）到陰性對照測試管

3． 移取400微升上述預(yù)處理的待測樣品到樣品本底測試管

4． 移取400微升上述預(yù)處理的待測樣品到樣品活性測試管

5． 分別加入xx微升強(qiáng)化液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管外

6． 分別加入xx微升發(fā)光液（Reagent C）到上述測試管，除樣品本底測試管外

7． 輕輕渦旋混勻

8． 即刻放進(jìn)37℃化學(xué)發(fā)光儀里測讀（注意：建議瞬時(shí)測讀或30秒內(nèi)測讀）

9． 整合測讀1秒，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit；RLU）

10． 或者測讀光電子讀數(shù)：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液體閃爍儀替代）

11． 計(jì)算ROS水平：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 測試前，動物組織須新鮮收集，1小時(shí)內(nèi)為

4． 組織裂解懸液制備后即刻測讀，不宜過夜保存

5． 組織裂解懸液須清澈

6． 如果測定體系變化，則試劑用量相應(yīng)變化

7． 系統(tǒng)操作過程中，陰性對照只需測定一次

8． 測讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行

9． 根據(jù)活性氧值濃度高低，用戶可以調(diào)整樣品量

10． 必要時(shí)，例如活性氧族過低，可以濃縮樣品處理

11． 如果是注射式化學(xué)發(fā)光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學(xué)發(fā)光儀注射（injector）管道

12． 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品