微量法 100管/48樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                           

β-GC（EC 3.2.1.21）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化β-糖苷鍵水解，具有多方面生理作用：在纖維素的糖化作用中，β-GC負(fù)責(zé)進(jìn)一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯類(lèi)香氣前驅(qū)體，使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味；β-GC能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷，釋放HCN，從而防止昆蟲(chóng)取食。

測(cè)定原理：

β-GC分解對(duì)-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在400nm有大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算β-GC活性。

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入12mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液、血清（漿）等液體樣本：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 加樣表

充分混勻，放入37℃準(zhǔn)確水浴30min后，立即放入95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變），8000g，4℃，離心5min，取上清液（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置2min后， 400nm處測(cè)定吸光值A，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

β-GC活力計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

（1）按液體體積計(jì)算：

單位的定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GC活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷V樣÷T

=56.98×(ΔA+0.0027)

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GC活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（3）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GC活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W

（4）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GC活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.114×(ΔA +0.0027)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。