注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格:50T/24S

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

可見分光光度

乙酰輔酶 A 羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶 A 羧化生成丙二酰輔酶 A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC 的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC 能夠催化乙酰輔酶 A、NaHCO₃ 和 ATP 生成丙二酰輔酶 A、ADP 和無機(jī)磷，鉬藍(lán)與磷酸根生成 660nm 有特征吸收峰的物質(zhì)，通過鉬酸銨定磷法測(cè)定無機(jī)磷的增加量來測(cè)定 ACC 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計(jì)、天平、低溫離心機(jī)、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、漩渦震蕩儀、水浴鍋、蒸餾水、冰盒、EP 管。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

提取液二：液體 0.6mL×1 支，-20℃避光保存； 試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 12.5mL 試劑一，充分溶解待用；可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 6mL 雙蒸水，充分溶解待用；可分裝后-20℃保存， 避免反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 15mL 雙蒸水，溶解后 4℃保存一周； 試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 15mL 雙蒸水，溶解后 4℃保存一周； 試劑六：液體 15mL×1 瓶，室溫保存；

標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 1mL×1 支，4℃保存；

提取液的配制：按提取液一：提取液二=990：10（V：V）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用， 禁止將提取液二一次性全部加入提取液一混勻分裝待用。

工作液（定磷劑）的配制：按 H₂O：試劑四：試劑五：試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的工作液應(yīng)為淺黃色。若變色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

注意：配試劑用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL

提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

細(xì)菌或細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

血清（漿）：直接測(cè)定。二、測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將 10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為 1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 操作表：(在 1.5ml 離心管中依次加入下列試劑) 酶促反應(yīng)：

三、ACC 活性計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為 x 軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程 y=kx+b，將ΔA 帶入方程得到 x（μmol/mL）

2、 ACC 活性的計(jì)算：

1. 按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位

ACC 酶活（U /mg prot）=x×V 總÷（V 樣×Cpr）÷T=20x÷Cpr。

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每小時(shí)每 g 組織產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。

ACC 酶活（U /g 鮮重）=x×V 總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T=20x÷W。

1. 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每小時(shí)每 10⁴ 個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。

ACC 酶活（U /10⁴ cell）=x×V 總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）÷V 樣總）÷T

=20x÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）。

2. 按液體體積計(jì)算

酶活定義：每小時(shí)每 mL 液體產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。

ACC 酶活（U /mL）=x×V 總÷V 樣÷T=20x。

V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本鮮重，g。

注意事項(xiàng)

1、 工作液（定磷劑）應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，正常顏色為淺黃色，如有變色或變藍(lán)則均為失效。

2、 此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管或 EP 管等試驗(yàn)器材均要求嚴(yán)格無磷。

3、 顯色結(jié)束后應(yīng)立即檢測(cè)。

4、 當(dāng)ΔA 大于 1 時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。