實(shí)驗(yàn)原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被植物半乳糖（Galactose）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物半乳糖（Galactose）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

實(shí)驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材：

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。

1. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

2. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9. 不能使用過期產(chǎn)品。

試劑盒性能：

1. 檢測(cè)范圍：10.0μg/mL –1000μg/mL。

2. 靈敏度：最檢測(cè)濃度小于10.0μg/mL。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。

技術(shù)小提示：

1. 當(dāng)混合或重溶蛋白溶液時(shí)，盡量避免起沫。

2. 為了避免交叉感染，配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、上樣、加不同試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請(qǐng)分別使用不同的移液槽。

3. 每次孵育時(shí)，請(qǐng)正確使用封板膠可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4. 混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無(wú)色，請(qǐng)避光保存；加入微孔板后，將由無(wú)色變成不同深度的藍(lán)色。

5. 終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致；加入終止液后，孔內(nèi)顏色由藍(lán)變黃；若孔內(nèi)有綠色，則表明孔內(nèi)液體未混勻；請(qǐng)充分混合。