主要用途

         細(xì)菌甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase）活性酶連續(xù)循環(huán)光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)底物甲羥戊酸受到甲羥戊酸激酶磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以分析樣品中甲羥戊酸激酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌樣品的甲羥戊酸激酶活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入200至500微升GENMED裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8． 加入12.5微升GENMED活性液（Reagent B）

9． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

10． 置于冰槽里15分鐘，期間每隔5分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

11． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用GENMED BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30031.1）

14． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)菌裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零

3． GENMED緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫 

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取130微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升GENMED酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入20微升GENMED底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升GENMED陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取130微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升GENMED酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入20微升GENMED底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)菌裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.2（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X光徑距離（光徑距離；厘米）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉(zhuǎn)換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取130微升GENMED緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入20微升GENMED酶促液（Reagent D）

4． 分別加入20微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入20微升GENMED底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入10微升GENMED陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)菌裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和10分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.2（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5（光徑距離；厘米）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉(zhuǎn)換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘