主要用途

細胞AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到AMPK磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用比色法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中AMPK活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中AMPK激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）         　毫升

裂解液（Reagent B）         　毫升

緩沖液（Reagent C）          　毫升

酶促液（Reagent D）          　微升

反應(yīng)液（Reagent E）          　微升

底物液（Reagent F）         　微升

陰性液（Reagent G）          　微升

產(chǎn)品說明書                 1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預(yù)處理

比色皿或酶標板：用于比色分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取65微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入5微升陰性液（Reagent G）

4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置2分鐘

5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入10微升反應(yīng)液（Reagent E）

8． 加入10微升底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

10． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘 

四、 樣品測定

1． 移取65微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入5微升待測樣品（注意：50微克組織蛋白；樣品須溶解）

4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置2分鐘

5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入10微升反應(yīng)液（Reagent E）

8． 加入10微升底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

10． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘 

五、 計算樣品活性

六、酶標板測定

1． 在96孔酶標板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品

2． 分別移取65微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入10微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入5微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克組織蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動96孔酶標板

6． 在30℃溫度下孵育2分鐘

7． 分別加入10微升反應(yīng)液（Reagent E）

8． 分別加入10微升底物液（Reagent F）

9． 輕輕搖動酶標板

10． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)

11． 活性計算：

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 加入底物液（Reagent F）后3秒內(nèi)即刻比色測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘

8． 比色測定后，比色皿須清洗*

9． 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于30分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 可以使用AMPK抑制劑（DORSOMORPHIN）作為抑制劑對照或陰性對照

13． 5’AMP活化蛋白激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

使用承諾

秉著“信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾"的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。