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Technical articles
更新時間：2021-03-23
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DNA 在自由基(如·OH)的攻擊下容易發(fā)生損傷,即脫氧戊糖遭到破環(huán),磷酸二脂鍵的斷裂,堿基的破環(huán)或脫落,便可進一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細胞固定于低熔點瓊脂糖中,取少量細胞涂在載玻片上,用堿高鹽溶液破壞細胞膜,再用堿溶液使 DNA 分子解旋。將載玻片置于電泳液中,在電場的作用下,DNA 分子向陽極移動。如果 DNA 損傷嚴重,碎片多,則電泳速度快。未受損傷的 DNA 大分子則由于細胞膜的阻隔,滯留在原處。用 PI 染色或銀染,可觀察到DNA 受損的細胞形同彗星現(xiàn)象,作定性分析。也可用相關的軟件作定量分析。
二、所需儀器及自備試劑
低速離心機、水平電泳儀、熒光顯微鏡、37℃和 45℃恒溫水浴箱、載玻片、蓋玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液、PBS
Propidium Iodide(PI)和EB 有毒,操作時要戴手套。
四、操作步驟
1、細胞用冰冷的PBS 洗一次,離心收集,用PBS 重懸使其密度為 1×106 個/mL；
2、鋪膠：下述各濃度瓊脂糖凝膠均用 PBS 配制
第 1 層凝膠的制備：將載玻片的磨砂面向上,45℃預熱,將預熱 45℃的 100μL 的 0.5%正常熔點瓊脂糖(NMA)鋪于載玻片上,蓋上干凈的蓋玻片,再置 4℃下 10min 使NMA 凝固。
第 2 層凝膠的制備：將 10μL 細胞(約 104 個)和 75μL 的 0.7%低溶點瓊脂糖LMA(在 37℃下水浴加熱至少 20min 使之*溶化)混合均勻。然后,輕輕揭去蓋玻片,迅速將含細胞的LMA 滴到第 1 層瓊脂糖上, 立即蓋上另一干凈蓋玻片,置 4℃ 10min 使第 2 層LMA 凝固。
第 3 層凝膠的制備：第 2 層LMA 凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,滴加預熱 37℃的 75μL 的 0.7%低溶點瓊脂糖LMA,如上蓋上蓋玻片 4℃下凝固(第三層覆蓋第二層周圍 0.5mm,增加凝膠化作用時間至 30min, 高濕度環(huán)境)。
3、細胞裂解
移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預冷的 Lysis Bufffer(使用前每 9mL 加入 1mL 的DMSO),4℃ 裂解 1～2h,取出載玻片用PBS 漂洗。
將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液(用戶自備 1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),約覆過載玻片膠面 0.25cm 左右,室溫放置 20～60min,以便使DNA 在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,使DNA 斷鏈在電場中易于遷移。
在電壓 25V,電泳 20～30min,電壓、電流可用改變緩沖液面高低來調節(jié)。6、中和與染色
電泳后將載玻片置于平皿內。加入 0.4mmol/L Tris-HCl(ph7.5)緩沖液,將載玻片沒入,4℃中和三次,每次 10min,棄去 Tris-HCl 緩沖液,每載玻片加 20μL 的 PI 染液或 EB 染液,蓋上蓋玻片,避光染色10min。
熒光顯微鏡 515～560nm 波長的激發(fā)光、PI 染色的DNA 圖象呈紅色,EB 染色的DNA 圖象呈桔紅色, 可清楚地觀察到核DNA 和遷移的DNA(即慧星尾)。每個樣本隨機選擇 100 個細胞,測定核DNA 直徑和DNA 遷移的長度,可并用相應的軟件分析。
當前位置：
