技術(shù)背景

細(xì)胞復(fù)制性衰老是細(xì)胞控制其生長(zhǎng)潛能的保障機(jī)制。衰老細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G1期，表現(xiàn)出細(xì)胞扁平、脹大、顆粒增多的形態(tài)特征，尤其在酸性條件下，細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性增加，而成為細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)記。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）     毫升

固定液（Reagent B）   毫升

酸性液（Reagent C）       毫升

稀釋液（Reagent D）   毫升

染色液（Reagent E）   毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)          1份

保存方式

保存染色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；稀釋液（Reagent D）和染色液（Reagent E）用鋁箔封裹，避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

2毫升離心管：用于配制染色工作液

15毫升錐形離心管：用于配制染色工作液

恒溫培養(yǎng)箱：用于染色孵育

光學(xué)顯微鏡：用于觀察染色后的細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

操作一、25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶染色

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的染色液（Reagent E）從－20℃的冰箱里取出，放進(jìn)冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀釋液（Reagent D）到2毫升離心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混勻后，放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱，標(biāo)記為染色工作液。然后進(jìn)行下列操作：

• 小心抽去25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗生長(zhǎng)中的細(xì)胞表面
• 小心抽去清理液
• 小心加入xx毫升固定液（Reagent B），覆蓋整個(gè)生長(zhǎng)表面
• 在室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去固定液
• 小心加入xx毫升酸性液（Reagent C），清洗細(xì)胞表面
• 小心抽去酸性液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟7和8一次
• 小心加入xx毫升染色工作液，覆蓋整個(gè)細(xì)胞表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育3小時(shí)至16小時(shí)，或細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色（注意：避免液體蒸發(fā)）
• 在光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)：表達(dá)衰老特異性β- 半乳糖苷酶的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，呈現(xiàn)藍(lán)色。

操作二、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板染色

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的染色液（Reagent E）從－20℃的冰箱里取出，放進(jìn)冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀釋液（Reagent D）到15毫升錐形離心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混勻后，放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱，標(biāo)記為染色工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1．小心抽去24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液

2．每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗生長(zhǎng)中的細(xì)胞表面

3．小心抽去每孔里的清理液

4．每孔加入xx微升固定液（Reagent B），覆蓋整個(gè)生長(zhǎng)表面

5．在室溫下孵育5分鐘

6．小心抽去固定液

7．每孔加入xx微升酸性液（Reagent C），清洗細(xì)胞表面

8．小心抽去酸性液

9．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟7和8一次

10．每孔加入xx微升染色工作液，覆蓋整個(gè)細(xì)胞表面

11．放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育3小時(shí)至16小時(shí)，或細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色（注意：避免液體蒸發(fā)）

12．在光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)：表達(dá)衰老特異性β- 半乳糖苷酶的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，呈現(xiàn)藍(lán)色

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為100次（4個(gè)24孔板）或20次（20個(gè)25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 本產(chǎn)品的參數(shù)：固著劑種類(lèi)和濃度、pH、生色底物的選擇和濃度等達(dá)到優(yōu)化
• 使用時(shí)，避免污染母液，否則出現(xiàn)絮狀沉淀，影響實(shí)驗(yàn)效果
• 染色工作液避免光照
• 細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性強(qiáng)，孵育3小時(shí)即顯示陽(yáng)性；細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性弱，則需要孵育24小時(shí)
• 細(xì)胞染色長(zhǎng)孵育時(shí)間為24小時(shí)
• 孵育時(shí)避免液體蒸發(fā)
• 本產(chǎn)品染色敏感，甚至對(duì)于微弱表達(dá)的酶活性仍然顯色清晰；用戶(hù)可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整孵育時(shí)間和染色工作液濃度，使染色恰到好處
• 細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色的部位為衰老細(xì)胞特異性β-半乳糖苷酶活性的地方
• 染色后的細(xì)胞樣品可以在4℃冰箱里長(zhǎng)期保存，同樣須避免光照
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整處理液：

• 本公司提供系列細(xì)胞衰老分析試劑產(chǎn)品