分光光度法 50 管/48樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

          MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中 MDH 是 TCA 循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH 在細(xì)胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH 分為NAD- 依賴的 MDH 和NADP-依賴的 MDH， NADP-MDH 主要存在于真核細(xì)胞中。

測定原理：

NADP-MDH 催化 NADPH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致 340nm 處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一、提取液 60 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑二、液體 50 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑三、粉劑×2 支，-20℃保存；臨用前加入 300μL 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四、粉劑×2 支，-20℃保存；臨用前加入 300μL 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

 樣本測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑二在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和反應(yīng) 1min

后的吸光度 A2，計算 ΔA=A1-A2。

注意：若 A1-A2 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋，使 A1-A2 小于 0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

NADP-MDH 活力單位的計算：

1、血清（漿）NADP-MDH 活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=6430×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP-MDH 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V 樣÷V 樣總×500）÷T=12.86×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。