主要用途

    細(xì)菌氧化應(yīng)激活性氧高質(zhì)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細(xì)菌氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測(cè)細(xì)菌活性氧族的生成和增加的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌菌株氧化應(yīng)激活性氧的分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定，滯留持久，熒光清晰。

技術(shù)背景

     細(xì)菌作為模式生物，是環(huán)境化學(xué)毒性研究的常用工具?；钚匝醯臋z測(cè)可以用于諸如多環(huán)芳烴化合物或重金屬的毒性作用以及修復(fù)（remediation）的評(píng)價(jià)指標(biāo)。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)產(chǎn)品，一種*自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定細(xì)菌活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）    毫升

染色液（Reagent B）    微升

稀釋液（Reagent C）    毫升

溶解液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于染色的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、直接測(cè)定

1. 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的待測(cè)菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細(xì)胞/毫升）
2. 移取200微升到1.5毫升離心管
3. 加入xx微升染色液（Reagent B），混勻
4. 轉(zhuǎn)移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
5. 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm）：每隔5分鐘測(cè)讀一次，持續(xù)120分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
6. 構(gòu)建活性氧和時(shí)間關(guān)系曲線

• ?二、培養(yǎng)上清測(cè)定

1. 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的待測(cè)菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細(xì)胞/毫升）
2. 移入到1.5毫升離心管
3. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4. 小心移取200微升上清液到1.5毫升離心管
5. 加入xx微升染色液（Reagent B），混勻
6. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育30至60分鐘，避免光照
7. 轉(zhuǎn)移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
8. 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高

三、細(xì)菌內(nèi)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入冰槽里。然后進(jìn)行下列操作。

1. 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的待測(cè)菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細(xì)胞/毫升）
2. 移入到1.5毫升離心管
3. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4. 小心抽掉上清液
5. 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
6. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
7. 小心抽掉上清液
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
9. 加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，混勻
10. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照
11. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
12. 小心抽掉上清液
13. 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
14. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
15. 小心抽掉上清液
16. 加入xx微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
17. 加入xx微升溶解液（Reagent D）
18. 上下傾倒混勻數(shù)次
19. 轉(zhuǎn)移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
20. 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
21. 或每隔5分鐘測(cè)讀一次，持續(xù)30分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
22. 構(gòu)建活性氧和時(shí)間關(guān)系曲線

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為50次操作
2. 操作時(shí)，須戴手套
3. 操作時(shí)，避免污染母液
4. 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
5. 孵育時(shí)，必須避免光照
6. 本產(chǎn)品染色劑不易洗掉，染色持久
7. 本公司提供陽性對(duì)照甲萘醌溶液（GMS12041），觀察細(xì)胞熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
8. 本公司同時(shí)提供細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)活性氧初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒（GMS10016.14），滿足不同用戶需求
9. 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品